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PCR CUANTITATIVA

Fundamentos

La PCR cuantitativa (qPCR), o en tiempo real, se realiza en un equipo que integra un termociclador convencional y un espectrofluorímetro que determina la fluorescencia que se produce en el tubo de amplificación en todo momento a lo largo del proceso. La PCR quantitativa combina la amplificación de DNA con la detección, teniendo lugar en un mismo tubo. El fluoróforo está presente constantemente en la reacción y la señal obtenida al final de cada ciclo de amplificación se representa en una gráfica frente al número de ciclos y se obtiene una curva que muestra el transcurso del proceso.

El equipo utiliza una lámpara de tungsteno para emitir la luz que excita al fluoróforo y una cámara CCD que determina la fluorescencia emitida a diferentes longitudes de onda en función del fluoróforo que se utiliza. La cámara CCd es multicanal, lo que permite realizar diversos análisis simultaneos en el mismo tubo de PCR.

La cuantificación se consigue mediante el empleo de una curva patrón en la que se representan las intesidades de fluorescencia conseguidas frente a las concentraciones conocidas de un fragmento identico al que se quiere cuantificar.

 

 

Aplicaciones

La PCR Cuantitativa tiene múltiples aplicaciones entre las que se encuentran:

  • Discriminación alélica
  • Expresión génica / Cuantificación de RNA
  • Detección de SNPs (single nucleotide polymorphisms)
  • Detección de patógenos / microorganismes (presència / absència)
  • Cuantificación  de OGMs (organismos genéticamente modificados)
  • Cuantas aplicaciones sean compatibles con el fundamento del equipo y de la técnica.

 

Equipamiento

 

  • ABI PRISM 7000 Sequence Detection System de Applied Biosystems.

PCR

 

 

  •  StepOne Plus de Life Technologies.

Equipo cofinanciado en un 80 por 100 por Fondos del Programa Operativo FEDER 2007/2013 de la Comunitat Valenciana y en un 20 por 100 por la Generalitat Valenciana

 

 

Requisitos de las muestras

  • Las muestras deben entregarse adecuadamente etiquetadas, envasadas y acondicionadas para asegurar su identificación, integridad y conservación durante el transporte y garantizar la seguridad del personal que lo realiza.
  • Las muestras deben entregarse en una placa adecuada al equipo Step One Plus y selladas con el film. En caso de que el usuario no disponga de ellos la Unidad se los podrá proporcionar aplicando en su caso la tarifa correspondiente.
  • El volumen de reacción estará comprendido entre 10 μl -30 μl y todos los pocillos deben contener el mismo volumen.
  • El usuario deberá descargarse el software del equipo StepOne Plus, el fichero de descarga se encuentra disponible en el LIMS (dentro de documentos UGP < Documentos PCR cuantitativa < StepOneSoftware), donde podrá rellenar toda la información necesaria para el experimento. El archivo se guardará con extensión .edt y se colgará en la solicitud del LIMS o se enviará por correo electrónico a los técnicos del servicio de Genómica.

Servicios Técnicos de Investigación


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